普通遗传学-第15部分
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噬菌体的增殖包括吸附、侵入、核酸复制与蛋白质合成、装配以及释放5个阶段（图5…4）。
1．吸附
大肠杆菌的T系列噬菌体以其尾丝尖端附着在大肠杆菌的细胞壁上。附着时，噬菌体是以其尾丝尖端的蛋白质吸附在菌体细胞表面的特异受体上的。不同噬菌体吸附在不同的受体上。例如T3、T4和T7噬菌体吸附在脂多糖受体上，T2和T6噬体的受体为脂蛋白。但是有尾巴的噬菌体并非都吸附在细菌的细胞壁上，有的吸附在细菌荚膜上，有的则吸附在细菌的鞭毛上。
2．侵入
T4噬菌体吸附在大肠杆菌细壁上后，先是尾丝收缩，使尾管碰及细胞壁，这时尾管的溶菌酶溶解接触处细胞壁中肽聚糖，在细胞壁中“钻”了一个小孔，然后通过尾鞘收缩，把尾管推出并插入细胞壁中，DNA就通过尾管“注射”到细菌细胞质中，而蛋白质外壳则留在菌体外（图5…4）。
图5…4 噬菌体的生活周期
3．核酸的复制、转录与蛋白质的生物合成
噬菌体DNA进入大肠杆菌后，双链DNA解螺旋，分别以（＋）、（…）链为模板复制出子代病毒±DNA从其中的（…）DNA转录出MRNA，合成病毒蛋白质。T7噬菌体的基因组和基因指导蛋白质合成的顺序见图5…5。
4．装配
装配是指将合成的病毒各部件装配在一起成为成熟病毒粒子的过程。T4噬菌体的装配过程：①头部壳体中装进DNA，成为成熟的头部。②由基板、尾管和尾梢等各部件装成尾部。③头部与尾部的装配。④总装，最终装上尾丝，成为成熟的噬菌体（图5…6）。已知，装配过程中至少有50种不同蛋白质和60多个基因参与。而且，装配需要在其中一些非结构蛋白的指导下进行。
5．释放
噬菌体借助于尾管的溶菌酶裂解宿主细胞，一下子释放出大量的子病毒。尽管噬菌体只有通过电子显微镜才能观察到，但我们可以通过观察噬菌体对细胞的影响，很容易对其进行计数。这种分析方法称为噬菌斑测验（plague assay）。在测验过程中，首先将噬菌体颗粒与细菌细胞在少量含有细菌生长营养成分溶化的琼脂中进行混合，然后将混合物倒入另一培养皿中固体琼脂培养基的上层，此时琼脂就会迅速凝固。当细菌经过一夜培养之后，就可形成一层均一的、混浊垫层，当噬菌体裂角细菌细胞后，细菌垫层上就会出现许多清晰的小孔，即噬菌斑（plaque）。
图5…5 噬菌体T7基因组及其产物
示早期蛋白、中期蛋白和晚期蛋白，并示基因大小。数字为基因编号。蛋白质合成从基因组左端开始
噬菌体是如何形成噬菌斑的呢？原来，在原始混合物中感染每一个细菌细胞的噬菌体都利用宿主细胞的DNA、RNA和蛋白质合成机器迫使细菌细胞合成组成噬菌体的产物，最后噬菌体DNA和蛋白质再装配完整的子代噬菌体。对于T4而言，大约在感染细菌后顾之25min，细胞裂解，可释放出数百个子代噬菌体。此时琼脂已经凝固，噬菌体不能漂浮开，而只能感染邻近细胞。这一过程反复重复下去，直到在细菌垫层上出现清晰可见的噬菌斑。
一般而言，原始悬浮培养液中的每一个噬菌体粒子都可能形成一个噬菌斑。因此，通过计数噬菌斑就可知道一定容量中侵染细菌的噬菌体或噬菌斑形成单位（plague…forming unit）数，因为一个细菌细胞只能被一个病毒粒子所感染。假定将最初的悬浮混合培养物按1∶105稀释，然后再取0。25ml涂布到细菌平板上；又假定我们从一个平板上获得了100个噬菌斑，据此就可计算出每毫升最初悬浮液含有400×105=4×107个噬菌体或噬菌斑形成单位。
5。1。3。2 温和噬菌体
某些温和噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主细菌染色体中。这种处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体（prophage）（图5…7）含有原噬菌体的细胞称为溶原性细菌（lysogenic bacteria）或溶原体。
图5…6 T4噬菌体的装配
装配从4个不同途径开始，数字示参与各步骤的T4基因的产物
原噬菌体虽然带有噬菌体的基因，但是在溶原性细菌中，它们所携带的遗传信息由于受噬菌体本身编码的一种特异阻遏物作用而得不到表达。所以，原噬菌体不进行DNA复制和蛋白质的合成，而随着宿主细菌染色体的复制而同步复制。并且，随着宿主细胞分裂而平均分配到两个子细胞中去，代代相传，这样便进入溶原周期（lysogenic cycle）（图5…8）。Apell（1962）提出λ噬菌体整合到寄主细菌的模型。λ噬菌体感染寄主细胞后，其染色体便由线状转变为环状。这一环状DNA分子以它的附着位点attP和细菌染色体DNA的同源位点attB发生联会，然后通过一次交换而整合到寄主染色体上。噬菌体中有很多温和噬菌体，例如λ、Mu…1、P1和P2等，其中P1噬菌体并不整合到细菌染色体上，而是独立存在于细胞质内。溶原性细菌对赋予其溶原性的噬菌体及其相关的噬菌体有免疫性。这是因为存在于每个溶原性细胞的细胞质中的cI阻遏物能结合到重复侵染的噬菌体基因的操作子（operator）上，从而阻止其复制和建立原噬菌体。但在某些情况下，溶原性细菌培养物中会有很小一部分（10…3～10…6）细胞，由于原噬菌体脱离整合状态，增殖产生大量子噬菌体而导致细菌细胞裂解。在自然情况下溶原性细菌的裂解称为自发裂解（spontaneous lysis）。若经紫外线、氮芥、X射线等理化因子处理，大部分甚至全部细菌细胞都会裂解。这种经诱导因子处理的高效率裂解称为诱发裂解（inducrive lvsis）。
图5…7 λ噬菌体的溶原化和原噬菌体形成，示环状λ基因组整合
到宿主染色体上的过程，POP′为attP位点，BOB′为attB位点
图5…8 温和噬菌体的生活周期
噬菌体基因组侵染细菌细胞时，能立即复制、产生成熟的噬菌体（裂解反
应），也能整合到细菌染色体上（溶原性反应）。整合的原噬菌体能被诱发
而进入裂解周期，也可能自然消失，使细胞变成敏感的细菌细胞
λDNA整合至大肠杆菌染色体的固定位点上，这个位点在gal（半乳糖代谢基因）和bio（维生素生物素合成基因）之间。它与λ的附着位点有相同的“核心序列”区，它们有15对相同的核苷酸：
5′ GCTTTTTTATACTAA 3′
3′ CGAAAAAATATGATT 5′
5。2 噬菌体的染色体作图
5。2。1 噬菌体的表型与噬菌体遗传学
由于噬菌体遗传分析是通过噬菌斑测验进行的，所以最初发现的某些T偶列噬菌体的突变体都形成异常噬菌斑。其中，r突变体就是典型例子之一，它形成很大的噬菌斑，由A。D。Hershey于1948年发现，并命名为r突变型即速溶（rapid lysis）之意。可能正是由于这种突变体能快速裂解宿主细胞，所以才能形成很大的噬菌斑。Hershey还证明r突变型确实是由于一个基因发生突变造成的，于是就将r基因的野生型等位基因称为r＋。
早期发现的T偶列噬菌体的另一个突变体称为T2h，h代表宿主范围（host range）。它是T2噬菌体的一种突变体，能够感染大肠杆菌细胞（Ttor）。野生型T2噬菌体不能感染Ttor大肠杆菌，所以宿主细胞Ttor细胞抗T2噬菌体侵染。由于野生型T2噬菌体（h＋）不能侵染Ttor，因此，它不能在这种菌株上形成噬菌斑。但是，将h＋野生型T2噬菌体涂布到Ttor和Ttor细胞的混合物上则可产生噬菌斑。T2噬菌体在这种细菌垫层上感染Ttor细胞，从而产生混浊的、含有未裂解的Ttor细胞的噬菌斑。
如果将两种不同的T2突变体进行杂交，就可对其杂交子代进行重组分析。杂交时，首先将Ttor和Ttor细胞混合，然后再同时接种高浓度的T2hr＋和T2h＋r两种毒株，以保证绝大多数细胞都被一个以上噬菌体感染。两种不同的噬菌体DNA就可在宿主细胞内进行重组，产生2种非亲本型子代T2h＋r＋和T2hr（图5…9）。
图5…9 T2噬菌体的h和r基因之间的重组
Ttor和Ttos2种细胞混合垫层便于区分子代噬菌体中有2对等位基因差异的4种组合。在这4种组合中，T2h＋r＋噬菌体产生小而混浊噬菌斑，其中r＋基因决定小噬菌斑表型，h＋基因决定混浊表型，T2h＋r噬菌体产生大而混浊的噬菌斑，T2hr＋噬菌体产生小而透明的噬菌斑；T2hr噬菌体产生大而透明的噬菌斑。
T偶列噬菌体的2种不同毒株之间的重组可以用于噬菌体基因的作图。例如Hershey从T2噬
菌体中分离到几种不同r突变型，编号为r1r2等，并对各种r突变体与h突变体之间的重组率进行了研究。其中有2种r突变体即r7和r13与h突变体之间的重组率分别为12。3％和1。7％，这表明在T2噬菌体的遗传图上r7与h突变体之间相距较远，而r12与h之间则相距较近。三者在染色体上的排列有以下2种方式：
h r13 r7
（a）
r13 h r7
（b）
为了确定这2种排列方式哪一种是正确的，需要分析r13与r7之间的重组率。如果二者之间的重组率大于h与r7之间的重组率，则表明b种排列方式是正确的。如果r13与r7这间的重组率小于h和r7的重组率，表明a种排列方式是正确的。实际结果是r13和r7之间的重组率小于h和r7之间的重组率，表明a是正确的。事实上，r7和r13分别位于是2个不同基因之中，其中任何一个发生突变，形成的噬菌斑在表型上都相同。根据上述作图原理，我们可以作出T2噬菌体的包括有4个基因的连锁图。以下是3种不同的r变型，分别以ra、rb和rc表示，每一突变都发生在不同基因之内，用rh＋×r＋h获得的试验结果列于表5…1。
表7…1 用rh＋×r＋h所得的4种噬菌斑数及算得的重组值
杂交组合 每种基因型的百分率 重组值
rh＋ r＋h r＋h＋ rh
rah＋×r＋h
rbh＋×r＋h
rch＋×r＋h 34。0
32。0
39。0 42。0
56。0
59。0 12。0
5。9
0。7 12。0
6。4
0。9 24％
12。3％
1。6％
根据表5…1结果，可以分别作出 ra、rb、rc与h的3个连锁图：
m 24 h
rb←12。3→h
rc←1。6→h
由于3个不同的r突变分别位于3个不同基因内，3个r基因与h基因在T2噬菌体染色体上有以下4种可能的排列顺序：
ra rb rc h
ra rc h rb
ra rb h rc
ra h rc rb
为了确定以上排列顺序哪些是正确的，可先只考虑rb、rc及h来确定是rc…h…rb还是h…rc…rb。为此还需作rcrb＋×rc＋rb杂交，测得其重组值为14％。将其重组值14％与rb…h之间的距离12。3％进行比较，据此可知h应位于rb和rc之间，所以排列顺序应是rc…h…rb。至于ra在h的哪一边，是靠近rb还是靠近rc？上述资料并未给予明确回答。由于T2噬菌体的染色体是环状的，所以ra…rc…h…rb和rc…h…rb…ra这2种排列顺序都是正确的。可将这4个基因用环状连锁图表示如下：
h
rc
rb
ra
在上述噬菌体遗传作图中，尽管资料开始很混乱，但是一旦了解染色体的环状构型后，进行重组分析和构建连锁图就相当便捷。
5。2。2 基因的细微结构作图
5。2。2。1 T4噬菌体rⅡ区的作图
同λ噬菌体一样，利用T4噬菌体的突变型，也可以检验T4噬菌体的基因重组。T4噬菌体中最先发现的突变型就是噬菌斑突变型。噬菌体T4中包括rⅡA和rⅡB基因的区段是一个广泛分析过的区段。快速溶菌r突变型产生的噬菌斑比野生型（r＋）颗粒大而界限更分明。这些突变型可与野生型相区别，因为后者在大肠杆菌B、S、K菌株上形成小而绒毛状的噬菌斑，而rⅡ突变型在B菌株上形成r型噬菌斑，在S菌株上形成野生型r＋噬菌斑，在K菌株上则根本不形成噬菌斑（图5…10a）。如果一个寄主细菌同时受到2个遗传型不同的噬菌体同时侵染，那么2个噬菌体染色体就会在被侵染的细胞中一起复制。其中有些会发生遗传重组，并产生新的具双亲标记的重组型。被侵染的细胞裂解后，根据对子代噬菌斑的分析，就可测定其中是否含有重组型。Benzer采用rⅡ突变型成对杂交，计算每对突变位置间的重组频率。他用每对rⅡ突变体对大肠杆菌B株进行双重感染，裂解后获得子代噬菌体。然后将裂解液涂布在rⅡ突变型和r＋噬菌体都能生长的大肠杆菌B株上，从而计数各种噬菌斑的数目。而要确定重组型的数目就只有将裂解液置于只有r＋重组型才能生长的大肠杆菌K株上（图5…10b）。由于双突变型的重组型不能检出，因此，重组值的估算值应乘以2。
重组可以发生在基因之间，也可以发生在某个基因之内，后者称为基因内重组（intragenic rebination）。基因内重组也是生物体遗传物质重组的普遍现象，因为基因实际上就是遗传物质的一个区段，当基因内某一位点受到损伤，就会使生物体表现出非野生型的表型，这种现象就是基因突变（gene mutation）。如果某个等位基因内部在不同位点上受到损伤，就会形成不同的突变等位基因，从而产生不同表型特征。将突变基因a1和a2分别以下列图像表示：
a1 * * * 双突变
a2 * 野生型
其中*表示正常基因内的突变位点，二者杂交，我们就可以清楚地看到，2个突变位点之间通过单交换，就可产生正常的野生型基因。
Benzer根�
