考博生化和分子生物学复习笔记-第8部分
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四、真核基因表达调控 （ 一）真核基因组结构特点 1。真核基因组结构庞大 哺乳类动物基因组DNA长达3×109个bp。 2。单顺反子 真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条 多肽链。 3。重复序列 在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。根据重复频率可将重 复序列区分为高度重复序列（106次）、中度重复序列（103～104）及单拷贝序列。单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或很少的几次。 4。基因不连续性 真核结构基因两侧存在不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部 尚有一些不为蛋白质所编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称为外显子，因此真核基因是不连续的。 （二）真核基因表达调控特点 1。RNA聚合酶 真核RNA聚合酶有三种，即RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，分别负责三种RNA转录。TATA盒结合蛋 白为三种聚合酶所共有。 2。活性染色体结构变化 （1）对核酸酶敏感。 （2）DNA拓扑结构变化。 天然状态的双链DNA以负性超螺旋的构象存在。当基因活化 时，RNA聚合酶前方的转录区DNA拓扑结构为正性超螺旋，后面的DNA则为负超螺旋，正性超螺旋不仅阻碍核小体结构形成，而且促进组蛋白 H 2A ·H2B二聚体的释放，有利转录。 （3）DNA碱基修饰变化。在真核DNA有约5％的胞嘧啶被甲基化为5甲基胞嘧啶，甲基化范围与基因表达程度是反比关系。处于转录活化状态的基因CpG序列一般是低甲基化的。 （4）组蛋白变化。 ①H1样组蛋白减少。②H 2A ·H2B二聚体不稳定性增加。③组蛋白修 饰：最常见的修饰有乙酰化、泛素化，修饰后使核小体结构变得不稳定。④H3组蛋白巯基 暴露。 3。正性调节占主导 提高了蛋白…DNA相互作用的指导性，经济有效。4。转录与翻译间隔进行 真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。 5。转录后修饰、加工
（三）真核基因转录激活调节 ☆ 1。顺式作用元件 顺式作用元件是特异转录因子的结合位点，按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动 子、增强子及沉默子。
（1）启动子。真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件 含7－20bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点，以及一个以上的功能组件。在这些功能组件中最具典型意义的就是TATA盒，TATA盒通常位于转录起始点上游…25至 30bp，控制转录起始的准确性及频率。典型的启动子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（ 或）GC盒组成，这类启动于通常具有一个转录起始点及较高的转录活性。然而，还有很多 启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一类管 家基因，这类启动于包括一个或数个分离的转录起始点；另一类启动子既不含TATA盒，也 没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，但多数转录活性很低或根本没有 转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。
（2）增强子 是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启 动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点 的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时， 增强子也无法发挥作用。
（3）沉默子某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因 转录起阻遏作用。
☆2。转录调节因子 （1）转录调节因子分类。两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子 所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。（2）转录调节因子结构。所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域； 此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质…蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化 结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式 是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋…环…螺 旋。②转录激活域——由30…100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又 有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作 用与亮氨酸拉链、螺旋…环…螺旋结构有关。 3。mRMA转录激活及其调节 真核RNA聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFⅡD组成成分TBP 识别TATA盒或启动元件，并有TFⅡA参与结合，形成TFⅡD…启动子复合物；继而在TGⅡ AF等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB聚合，形成一个功能性的前起始复合物。在 几种基本转录因子中，TFⅡD是唯一具有位点特异的DNA结合能力的转录因子，在上述有 序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动 mRMA转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与TFⅡD结合，从而影响 前起始复合物的形成、稳定性以及RNA聚合酶的活性。
◆克隆与克隆化 所谓克隆就是指同一副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化。为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多 相同分子的集合，即为分子克隆。
2。DNA克隆 是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因 转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
3。工具酶（1）限制性内切酶（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段 （3）DNA聚合酶Ⅰ：a。合成双链cDNA中第二条链。 b。缺口平移制做探针。 c。DNA序列分析。 d。填补3′末端。 （4）Taq酶催化PCR反应，聚合DNA （5）反转录酶a。合成cDNA。b。替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 （6）多聚核苷酸激酶催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 （7）碱性磷酸酶切除DNA5′末端磷酸基 （8）末端转移酶在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。（9）DNA酶：切割DNA （10）RNA酶：切割RNA。
★ 重组DNA的基本原理 ①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的 基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体 细胞（转化子）。
（一）目的基因的获取1。化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该 多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 2。基因组DNA：采用物理方法（剪切或超声波）或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片 段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带 一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全 部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某 一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。 3。 cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就 可以筛选分离到目的基因。 4。聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的 Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶 促合成，使目的基因按指数增长。
（二）克隆载体的选择与改建 1。质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛 选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 2。噬菌体：egλ噬菌体、MB载体 3。柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 4。病毒载体。
（三）外源基因与载体的连接 即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。1。粘性末端连接（1）同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。 （2）不同限制酶切割位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同 类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。 2。平端连接 3。同聚物加尾连接 同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移 酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 4。人工接头连接
（四）重组 DNA导入受体细胞 根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手 段。 1。感受态细胞。经一定方法处理（如CaCl2处理）后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体 菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。 2。转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞，只针对大肠杆菌。 转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。 转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体 菌。 感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。
（五）重组体的筛选 1。直接选择法 直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测 定基因表型。 （1）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因 的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。 （2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补， 那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。 （3）分子杂交法 2。免疫学方法 应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属非直接选择法。特异性强、灵敏度 高，适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。
（六）克隆基因的表达
1。原核表达体系 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠 杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序 列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正 确衔接表达产物的分离、纯化。 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的 cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不 能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有 活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。
2。真核表达体系 与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优 势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA； 将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡 聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
三、重组DNA技术与医学的关系 1。疾病基因的发现 通过对基因研究认识疾病分子机制的一个典型例子是脆性X综合症。 2。发展生物制药 3。 DNA诊断 DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病 所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 4。基因治疗 所谓基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补充基因缺陷，从而达到治疗的目的。 5。遗传病的预防 （1）产前诊断。 （2）携带者测试。 （3）症候前诊断。 （4）遗传病易感性。
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